Expression of endoglucanases in Pichia pastoris under control of the GAP promoter
- 作者
- Aniko Várnai, Campbell Tang, Oskar Bengtsson, Andrew Atterton, Geir Mathiesen, Vincent GH Eijsink
- 单位
- 挪威生命科学大学化学、生物技术与食品科学系；过程创新中心
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2014）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-13-57
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在PichiaPink™表达系统中实现内切葡聚糖酶的组成型表达，避免使用有毒且易燃的甲醇诱导剂，同时维持与AOX1启动子相当或更高的产酶水平。
研究策略
构建携带组成型GAP启动子的pPink-GAP载体，将来自Aspergillus fumigatus的AfCel12A和Thermoascus aurantiacus的TaCel5A分别置于AOX1或GAP启动子下，转化PichiaPink™ Strain 4，比较不同启动子的表达效果，并在15 L生物反应器中优化培养条件（温度、碳源、补料速率）。
研究路线图
核心内容
该研究在PichiaPink™表达系统中构建了携带组成型GAP启动子的pPink-GAP载体，将来自烟曲霉的AfCel12A和嗜热毁丝霉的TaCel5A分别置于GAP或AOX1启动子下表达，旨在以无甲醇的组成型表达替代有毒易燃的甲醇诱导体系。在15 L生物反应器中系统优化了碳源、温度和补料速率，结果显示甘油为碳源且30°C培养时效果最佳，总分泌蛋白可达3–5 g/L，最高至7.3 g/L；AfCel12A的CMCase活性为1200±100 nkat/ml，占总分泌蛋白36%，而TaCel5A活性为170±10 nkat/ml，占4%。增加甘油补料量使TaCel5A菌株总蛋白从2.8 g/L升至3.8 g/L，但AfCel12A菌株无明显变化，表明启动子效果因目标蛋白而异。纯化后两种酶的比活力分别为1040和1450 nkat/mg。该工作证明GAP启动子可有效替代AOX1用于工业规模的无甲醇纤维素酶生产，为毕赤酵母组成型表达系统提供了可行方案。
创新点
['首次在PichiaPink™系统中构建并应用组成型GAP启动子表达载体pPink-GAP，替代甲醇诱导的AOX1启动子。', '通过优化培养条件（甘油为碳源、30°C、增加补料速率）使总分泌蛋白达到约5 g/L，AfCel12A占总分泌蛋白36%。', '系统比较了GAP与AOX1启动子对两种不同GH家族内切葡聚糖酶表达的影响，发现效果因蛋白而异。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris PichiaPink Strain 4 | 甲醇代谢 | AOX1 | Alcohol oxidase 1 | 调控 | 甲醇诱导型启动子，用于对照表达 |
| Pichia pastoris PichiaPink Strain 4 | 糖酵解 | GAP | Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase | 调控 | 组成型启动子，用于无甲醇表达 |
| Pichia pastoris PichiaPink Strain 4 | 纤维素降解 | cel12A | AfCel12A | 催化 | 来自Aspergillus fumigatus的GH12家族内切葡聚糖酶，带天然分泌信号 |
| Pichia pastoris PichiaPink Strain 4 | 纤维素降解 | eg1 | TaCel5A | 催化 | 来自Thermoascus aurantiacus的GH5家族内切葡聚糖酶，带天然分泌信号 |
关键发现
在15 L生物反应器优化条件下，GAP启动子重组菌株总分泌蛋白达3-5 g/L（最高7.3 g/L），CMCase活性分别为AfCel12A 1200±100 nkat/ml、TaCel5A 170±10 nkat/ml。纯化后比活力AfCel12A为1040 nkat/mg，TaCel5A为1450 nkat/mg。最佳条件下AfCel12A占总分泌蛋白36%，TaCel5A占4%。增加甘油补料量（1714 g至2470 g）使TaCel5A菌株总蛋白从2.8 g/L增至3.8 g/L，而AfCel12A菌株无显著变化。甘油作为碳源优于葡萄糖，30°C培养相比25°C可减少背景蛋白比例。
研究结论
成功在PichiaPink™系统中利用GAP启动子实现两种真菌内切葡聚糖酶的组成型分泌表达，优化培养条件后达到可观的蛋白产量，表明GAP启动子可替代AOX1启动子用于工业规模的无甲醇酶生产。