Transcriptional response of P. pastoris in fed-batch cultivations to Rhizopus oryzae lipase production reveals UPR induction
- 作者
- David Resina, Mónika Bollók, Narendar K Khatri, Francisco Valero, Peter Neubauer, Pau Ferrer
- 单位
- Departament d'Enginyeria Química, Escola Técnica Superior d'Enginyeria, Universitat Autònoma de Barcelona; Bioprocess Engineering Laboratory, Department of Process and Environmental Engineering and Biocenter Oulu, University of Oulu; SOLVO Biotechnology
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2007）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-6-21
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究巴斯德毕赤酵母在补料分批培养中生产米根霉脂肪酶（ROL）时的转录响应，揭示未折叠蛋白应答（UPR）的诱导机制，并分析比生长速率、碳氮源及HAC1过表达对相关基因转录水平的影响。
研究策略
采用磁珠夹心杂交法定量检测AOX1、FLD1、PDI、KAR2、26S rRNA和ROL等基因的mRNA水平，结合摇瓶和补料分批发酵实验，比较不同碳氮源组合、不同比生长速率（0.01 h-1和0.02 h-1）以及HAC1组成型表达菌株中的转录变化。
研究路线图
核心内容
该研究以巴斯德毕赤酵母生产米根霉脂肪酶（ROL）为模型，利用磁珠夹心杂交法定量检测了补料分批培养中AOX1、FLD1、KAR2、PDI及ROL等基因的mRNA水平，系统考察了碳氮源组合、比生长速率及HAC1组成型表达对转录响应的影响。结果表明，ROL过表达显著触发未折叠蛋白应答，甲醇培养中AOX1 mRNA达约30 fmol/μg总RNA，而ROL mRNA在BMM培养基中比BMS高3–4倍；在生长限制性条件下（0.01 h⁻¹），KAR2 mRNA瞬时诱导约6倍并持续20小时。在碳过量条件（0.02 h⁻¹）下，X-33 pROL菌株的AOX1 mRNA峰值（8.9 fmol/μg总RNA）高于GS115H pROL，但后者最大比脂肪酶活性（10928 AU/g细胞干重）优于前者。组成型表达酿酒酵母HAC1可显著降低UPR标记基因的诱导水平并提升ROL分泌效率。这表明转录水平是生长限制条件下ROL生产的主要瓶颈，而折叠与分泌效率在碳过量时更为关键，HAC1预适应策略为缓解异源蛋白生产中的UPR限制提供了可行方案。
创新点
首次将磁珠夹心杂交法应用于毕赤酵母发酵样品的特定mRNA定量分析；证明ROL过表达触发UPR；发现组成型表达酿酒酵母HAC1基因可降低UPR标记基因的诱导水平，同时提高ROL分泌效率。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X-33 | 甲醇代谢 | AOX1 | 醇氧化酶 | 催化 | 受甲醇诱导，被甘油/葡萄糖抑制，山梨醇为非抑制碳源 |
| Pichia pastoris X-33 | 甲醇代谢/甲胺同化 | FLD1 | 甲醛脱氢酶 | 催化 | 受甲醇和甲胺协同诱导 |
| Pichia pastoris X-33 | 蛋白质折叠/UPR | PDI | 蛋白二硫键异构酶 | 催化 | 催化二硫键形成，UPR标记基因 |
| Pichia pastoris X-33 | UPR | KAR2 | BiP分子伴侣 | 调控 | HSP70家族，参与未折叠蛋白应激反应，UPR标记基因 |
| Pichia pastoris X-33 | 脂质分解 | ROL | 米根霉脂肪酶 | 催化 | 重组目标蛋白，受FLD1启动子控制 |
| Pichia pastoris GS115H | UPR | HAC1 | 转录因子 | 调控 | 酿酒酵母来源，组成型表达，预适应UPR |
| Pichia pastoris X-33 | 核糖体合成 | 26S rRNA | — | 催化 | 核糖体RNA，反映生长速率 |
关键发现
- 在甲醇培养中，AOX1 mRNA水平达到约30 fmol/μg总RNA
- FLD1 mRNA约12 fmol/μg总RNA
- ROL mRNA在BMM培养基中比BMS高3-4倍。在生长限制性补料分批培养（0.01 h-1）中，KAR2 mRNA瞬时诱导约6倍，持续约20小时。在碳过量条件（0.02 h-1）下，X-33 pROL菌株的AOX1 mRNA最大值为8.9±1.82 fmol/μg总RNA，而GS115H pROL菌株为5.3±0.71 fmol/μg总RNA。GS115H pROL的最大比脂肪酶活性为10928 AU/g细胞干重，高于X-33 pROL的8008 AU/g。ROL过表达引起KAR2和PDI转录上调，但在HAC1组成型表达菌株中这些UPR标记基因的诱导水平显著较低。
研究结论
ROL过表达和分泌触发UPR，导致蛋白折叠和分泌成为高比生长速率下ROL生产的瓶颈；组成型表达酿酒酵母HAC1基因可预适应UPR，降低UPR相关基因的诱导水平并提高ROL分泌效率。转录水平是生长限制条件下ROL生产的主要限制因素，而折叠/分泌效率在碳过量条件下更为关键。