A comparative transcriptome analysis of the novel obligate methanotroph Methylomonas sp. DH-1 reveals key differences in transcriptional responses in C1 and secondary metabolite pathways during growth on methane and methanol
- 作者
- Anh Duc Nguyen, Donghyuk Kim, Eun Yeol Lee
- 杂志
- BMC Genomics（2019）
- DOI
- 10.1186/s12864-019-5487-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
阐明新型专性甲烷氧化菌Methylomonas sp. DH-1在以甲烷和甲醇为唯一碳源时的全局转录组差异，揭示C1同化与次级代谢途径中的关键转录响应机制
研究策略
利用RNA-seq对分别以甲烷和甲醇生长的Methylomonas sp. DH-1进行全基因组转录组测序，结合基因组注释和差异表达分析（fold-change≥2, P≤0.05），并采用COG功能分类、直系同源分析及突变体验证等手段解析代谢通路及调控网络
核心内容
本研究对新型专性甲烷氧化菌Methylomonas sp. DH-1在甲烷与甲醇两种碳源下的全基因组转录组进行了比较分析。通过RNA-seq测序，共覆盖4318个染色体编码序列和242个质粒编码序列，平均每样本获得约3000万条读段，比对率达98%。结果显示，甲醇培养相较于甲烷有261个基因上调和723个基因下调。甲烷条件下颗粒甲烷单加氧酶操纵子pmoCAB表达最高，其中pmoC表达约为pmoA和pmoB的2.5倍；切换至甲醇后三者分别下调2.87、5.46和2.74倍。甲醇培养时，甲醛氧化通路和丝氨酸循环关键基因如fch、sga、mclA显著上调，而TCA循环相关基因及ppc明显下调，表明碳源切换后中央代谢转向甲醛氧化以减少NADH产生，TCA循环侧重提供前体。类胡萝卜素合成基因dxs1和dxs2分别上调2.5和3.1倍，藿烷类合成基因上调达6.4倍，这可能与该菌株的高甲醇耐受性相关。内源质粒pDH1上约90%的基因呈极高表达，暗示其具有重要代谢功能。该菌株可将甲烷转化为甲醇（效价1.34 g/L）及将丙烷转化为丙酮（16.62 mM）。研究为理解专性甲烷氧化菌的碳源适应机制及代谢工程改造奠定了理论基础。
创新点
首次报道Methylomonas sp. DH-1的完整转录组分析；发现其具有完整的丝氨酸循环和氧化性TCA循环；揭示甲醇培养时甲醛氧化通路、丝氨酸循环及类胡萝卜素/藿烷类合成途径的显著上调，并关联其高甲醇耐受性；证实内源质粒pDH1上的基因高度表达可能对代谢有重要作用
研究对象（40）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲烷氧化 | pmoC | 颗粒甲烷单加氧酶C亚基 | 催化 | 甲烷培养时高表达，甲醇培养时下调2.87倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲烷氧化 | pmoA | 颗粒甲烷单加氧酶A亚基 | 催化 | 甲醇培养时下调5.46倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲烷氧化 | pmoB | 颗粒甲烷单加氧酶B亚基 | 催化 | 甲醇培养时下调2.74倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲烷氧化 | pmxA | 非经典甲烷/氨单加氧酶A亚基 | 催化 | 表达很低，可能不参与主要催化 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲醇氧化 | mxaF | 甲醇脱氢酶大亚基 | 催化 | 甲烷和甲醇下均高表达 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲醇氧化 | mxaI | 甲醇脱氢酶小亚基 | 催化 | 与mxaF共转录 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲醇氧化 | xoxF | 依赖镧的甲醇脱氢酶 | 催化 | 甲醇培养时下调3.65倍，可能参与甲烷氧化 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲醇氧化辅因子合成 | pqqABCDE | 吡咯喹啉醌生物合成酶 | 催化 | 提供甲醇脱氢酶辅因子PQQ |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲醛氧化（H4MPT） | fae2 | 甲醛激活酶2 | 催化 | H4MPT途径关键酶，甲醇培养时上调 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲醛氧化（H4MPT） | fch | 次甲基四氢甲烷喋呤环化水解酶 | 催化 | 甲醇培养时上调2.18倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲醛氧化（H4F） | folD或fchA（推测） | 四氢叶酸途径相关酶 | 催化 | 甲醇培养时该途径基因表达略有上升 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 甲酸氧化 | fdsABGCD | NAD依赖性甲酸脱氢酶 | 催化 | 氧化甲酸生成CO2并产生NADH |
| Methylomonas sp. DH-1 | RuMP循环 | hps | 己酮糖磷酸合成酶 | 催化 | RuMP循环关键酶，极高表达 |
| Methylomonas sp. DH-1 | RuMP循环 | phi | 磷酸己酮糖异构酶 | 催化 | RuMP循环关键酶，极高表达 |
| Methylomonas sp. DH-1 | EMP途径 | fbp | 果糖-1,6-二磷酸酶 | 催化 | 甲醇培养时上调 |
| Methylomonas sp. DH-1 | EMP途径 | tpi | 磷酸丙糖异构酶 | 催化 | 甲醇培养时上调 |
| Methylomonas sp. DH-1 | EMP途径 | gpmI | 磷酸甘油酸变位酶 | 催化 | 甲醇培养时上调 |
| Methylomonas sp. DH-1 | EMP途径 | pyk | 丙酮酸激酶 | 催化 | 极高表达，甲醇培养时上调 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 丝氨酸循环 | sga | 丝氨酸-乙醛酸氨基转移酶 | 催化 | 甲醇培养时上调2.1倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 丝氨酸循环 | mdh | 苹果酸脱氢酶 | 催化 | 甲醇培养时上调1.7倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 丝氨酸循环 | mclA | 苹果酰辅酶A裂解酶 | 催化 | 甲醇培养时上调2.78倍，直接产生乙酰-CoA |
| Methylomonas sp. DH-1 | 丝氨酸循环 | ppc | 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 | 催化 | 甲醇培养时下调9.6倍，属于调控型 |
| Methylomonas sp. DH-1 | TCA循环 | sucCD | 琥珀酰辅酶A合成酶 | 催化 | 甲醇培养时显著下调 |
| Methylomonas sp. DH-1 | TCA循环 | sdh | 琥珀酸脱氢酶 | 催化 | 甲醇培养时显著下调；突变体实验支持完整TCA循环 |
| Methylomonas sp. DH-1 | TCA循环 | idh1 | 异柠檬酸脱氢酶 | 催化 | 甲醇培养时显著下调 |
| Methylomonas sp. DH-1 | MEP/类胡萝卜素合成 | dxs1 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶1 | 催化 | 甲醇培养时上调2.5倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | MEP/类胡萝卜素合成 | dxs2 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶2 | 催化 | 甲醇培养时上调3.1倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | MEP/类胡萝卜素合成 | ispE | 4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 | 催化 | MEP途径中表达最高 |
| Methylomonas sp. DH-1 | MEP/类胡萝卜素合成 | ispH | 4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶 | 催化 | 高表达 |
| Methylomonas sp. DH-1 | MEP/类胡萝卜素合成 | dxr | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 高表达 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 类胡萝卜素/藿烷类共同上游 | sgs | 角鲨烯/八氢番茄红素合成酶 | 催化 | 甲醇培养时上调5.7倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 藿烷类生物合成 | hpnH | 自由基SAM蛋白 | 催化 | 甲醇培养时上调6.4倍 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 藿烷类生物合成 | hpnG | 磷酸化酶 | 催化 | 参与hopanoid生成 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 藿烷类生物合成 | hpnO | 氨基转移酶 | 催化 | 参与hopanoid生成 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 藿烷类生物合成 | hpnR | 藿烷C-3甲基化酶 | 催化 | 高表达 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 藿烷类转运 | hpnN | 藿烷转运蛋白 | 转运 | 将hopanoid定位到外膜 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 藿烷类生物合成 | hpnM | 藿烷生物合成蛋白 | 催化 | 参与hopanoid合成 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 氧化应激防御 | sod | 超氧化物歧化酶 | 催化 | 两种SOD（Mn/Fe）均表达，甲醇下微上调 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 氧化应激防御 | cat | 过氧化氢酶 | 催化 | 甲烷下中等表达，甲醇下略降 |
| Methylomonas sp. DH-1 | 氧化应激防御 | prdx | 过氧化物氧化还原蛋白 | 催化 | 三个拷贝均表达，无显著差异 |
关键发现
- 在甲烷和甲醇培养下，分析了4318个染色体CDS和242个质粒CDS，平均每个样本获得约30 million reads，Q30>96%，98% reads比对到参考基因组
- 甲醇培养相对甲烷有261个基因上调和723个基因下调（fold-change≥2, P≤0.05）
- pmoCAB操纵子在甲烷下最高表达，其中pmoC表达约为pmoA/pmoB的2.5倍，甲醇培养时pmoC、pmoA、pmoB分别下调2.87、5.46和2.74倍
- xoxF在甲醇培养时下调3.65倍
- fch在甲醇下上调2.18倍
- 丝氨酸循环中sga上调2.1倍，mdh上调1.7倍，mclA上调2.78倍
- ppc下调9.6倍
- TCA循环中sucCD、sdh和idh1在甲醇下显著下调
- 类胡萝卜素途径dxs1和dxs2分别上调2.5和3.1倍，sgs上调5.7倍
- 藿烷类合成基因上调3.4–6.4倍，其中hpnH上调6.4倍
- 氧化应激相关基因中zwf上调2.1倍，一个谷胱甘肽S-转移酶基因上调2.2倍
- 内源质粒pDH1上90%（甲烷）和87.6%（甲醇）的基因呈极高表达水平
- 琥珀酸脱氢酶突变体与野生型生长速率无差异，但培养基中积累琥珀酸，支持完整氧化性TCA循环的存在
- 该菌株可将甲烷转化为甲醇，效价1.34 g/L，将丙烷转化为丙酮，效价16.62 mM
研究结论
Methylomonas sp. DH-1以RuMP循环和EMP途径为主要C1同化途径，同时具有完整的丝氨酸循环和氧化性TCA循环；当碳源从甲烷切换为甲醇时，中央代谢向甲醛氧化和丝氨酸循环转移以减少NADH产生，TCA循环转而主要提供前体；甲醇诱导类胡萝卜素和藿烷类生物合成上调，这可能与高甲醇耐受性有关；该研究为Methylomonas sp. DH-1的代谢工程改造提供了理论基础。