Combined metabolome and transcriptome profiling provides new insights into diterpene biosynthesis in S. pomifera glandular trichomes
- 作者
- Fotini A. Trikka, Alexandros Nikolaidis, Codruta Ignea, Aphrodite Tsaballa, Leto-Aikaterini Tziveleka, Efstathia Ioannou, Vassilios Roussis, Eleni A. Stea, Dragana Božić, Anagnostis Argiirou, Angelos K. Kanellis, Sotirios C. Kampranis, Antonios M. Makris
- 单位
- Institute of Applied Biosciences/CERTH, P.O. Box 60361, Thermi 57001, Thessaloniki, Greece; Department of Biochemistry, School of Medicine, University of Crete, P.O. Box 2208, Heraklion 71003, Greece; Department of Pharmacognosy and Chemistry of Natural Products, Faculty of Pharmacy, University of Athens, Panepistimiopolis Zografou, Athens 15771, Greece; Group of Biotechnology of Pharmaceutical Plants, Laboratory of Pharmacognosy, Department of Pharmaceutical Sciences, Aristotle University of Thessaloniki, 541 24 Thessaloniki, Greece; Institute for Biological Research "Sinisa Stankovic", University of Belgrade, Belgrade, Serbia
- 杂志
- BMC Genomics（2015）
- DOI
- 10.1186/s12864-015-2147-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析萨氏鼠尾草（Salvia pomifera）腺毛中鼠尾草酸类二萜生物合成途径的关键酶，为通过微生物合成替代天然提取提供基因资源
研究策略
结合代谢组学与转录组学分析，从S. pomifera叶片分离鉴定二萜代谢物，对腺毛转录组进行高通量测序与组装注释，挖掘与miltiradiene合成相关的候选基因，并在酿酒酵母中进行异源表达和功能表征，同时系统分析细胞色素P450基因
核心内容
本研究以希腊鼠尾草（Salvia pomifera）叶片腺毛为对象，结合代谢组学与转录组学解析二萜类化合物生物合成途径。通过超高通量测序获得约5400万条原始reads，组装得到66,051条长contigs并注释出43,656个单基因；同时从叶片中分离鉴定6种二萜化合物，其中1种为新天然产物2α-羟基-O-甲基-松脂酸。基于转录本表达量筛选，克隆并功能表征了两个关键酶：柯巴基二磷酸合酶SpCDS（unigene32268，FPKM 210.2）和miltiradiene合酶SpMilS（CL463.contig4，FPKM 140.3），在酿酒酵母中异源共表达两者后实现miltiradiene产量32 mg/L。转录组分析显示MVA途径相关基因表达普遍高于MEP途径，且发现最高表达的细胞色素P450基因SpCYP76AH24 ortholog（FPKM 2026.30）与已知ferruginol合酶高度同源。研究提供了丰富的基因序列资源，为阐明鼠尾草酸家族二萜完整生物合成途径及通过微生物异源生产替代天然提取奠定了重要基础。
创新点
从S. pomifera叶片中分离并鉴定了1个新天然产物2α-羟基-O-甲基-松脂酸（2α-hydroxy-O-methyl-pisiferic acid）；克隆并表征了参与miltiradiene合成的两个关键酶SpCDS和SpMilS；提供了丰富的CYP450转录本资源，为揭示鼠尾草酸家族代谢物的完整生物合成途径奠定基础
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Salvia pomifera (希腊鼠尾草) 叶片腺毛 | 二萜生物合成（MEP/MVA途径） | SpCDS (unigene32268) | copalyl diphosphate synthase | 催化 | 催化GGPP环化生成(+)-CPP，FPKM=210.2 |
| Salvia pomifera (希腊鼠尾草) 叶片腺毛 | 二萜生物合成（MEP/MVA途径） | SpMilS (CL463.contig4) | miltiradiene synthase | 催化 | 催化(+)-CPP转化为miltiradiene，FPKM=140.3 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 菌株AM238 | 二萜生物合成（异源重建） | SpCDS, SpMilS | SpCDS, SpMilS | 催化 | 共表达后miltiradiene产量达32 mg/L |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 菌株AM238 | 萜类前体供给 | ERG20 (F96C突变体) | Erg20p(F96C) 变体 | 催化 | 工程化改造为GGPP合酶，提高GGPP供给 |
| Salvia pomifera (希腊鼠尾草) 叶片腺毛 | 二萜生物合成 | SpCYP76AH24 ortholog (unigene29490) | CYP76AH24 细胞色素P450 | 催化 | FPKM=2026.30，与ferruginol合酶高度同源，推测催化miltiradiene/abietatriene羟基化生成ferruginol |
| Salvia pomifera (希腊鼠尾草) 叶片腺毛 | 萜类生物合成 | DXS (unigene32091) | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (DXS) | 催化 | MEP途径第一个酶，FPKM=688.42，与S. miltiorrhiza DXS2高度相似 |
| Salvia pomifera (希腊鼠尾草) 叶片腺毛 | 萜类生物合成 | HMGR (cl1563.contig2) | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (HMGR) | 催化 | MVA途径关键酶，FPKM=1273.02，表达量高于MEP途径DXS |
| Salvia pomifera (希腊鼠尾草) 叶片腺毛 | rosmarinic acid 生物合成 | SpCYP73A120 ortholog, SpCYP98A75 ortholog | 肉桂酸4-羟化酶, 对香豆酰辅酶A 3'-羟化酶 | 催化 | FPKM分别为760.08和150.89，参与迷迭香酸生物合成 |
关键发现
- 共获得约54,000,000条原始reads，其中85%为高质量reads
- 组装得到125,371条contigs（平均长度321 nt），再组装为66,051条更长contigs（平均长度640 nt），其中22,395个聚类、43,656个单基因
- 分离并鉴定6种二萜化合物，其中1种为新化合物
- SpCDS（unigene32268）FPKM为210.2，SpMilS（CL463.contig4）FPKM为140.3
- 在酵母中异源共表达SpCDS和SpMilS实现miltiradiene产量32 mg/L
- MVA途径相关转录本表达水平普遍高于MEP途径
- 最高表达的CYP为SpCYP76AH24 ortholog（FPKM=2026.30），与已知ferruginol合酶高度同源
研究结论
本研究通过代谢组和转录组联合分析，鉴定出S. pomifera叶片腺毛中参与miltiradiene生物合成的两个关键酶（SpCDS和SpMilS），并构建了完整的CYP450基因资源，为阐明鼠尾草酸家族二萜的生物合成途径及后续微生物异源生产提供了重要基础