Heterologous expression and processing of the flavescence dorée phytoplasma variable membrane protein VmpA in Spiroplasma citri

作者: Joël Renaudin, Laure Béven, Brigitte Bataille, Sybille Duret, Delphine Desqué, Nathalie Arricau-Bouvery, Sylvie Malembic-Maher, Xavier Foissac
单位: INRA, UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie, Villenave d'Ornon, France; Université de Bordeaux, UMR 1332 Biologie du Fruit et Pathologie, Villenave d'Ornon, France; Université de Bordeaux, UMS3420, Bordeaux Imaging Center, Bordeaux, France; CNRS, Bordeaux Imaging Center, UMS 3420 Bordeaux, France; INSERM, Bordeaux Imaging Center, US 004 Bordeaux, France
杂志: BMC Microbiology（2015）
DOI: 10.1186/s12866-015-0417-5
所属领域: 合成生物学
关键词: Flavescence doréePhytoplasmaPhytoplasma effectorProtein secretionSpiroplasma citriSurface expressionVariable membrane protein
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解决的核心问题

植原体无法离体培养，难以研究其表面蛋白（特别是VmpA）与宿主昆虫/植物之间的相互作用。

研究策略

利用可培养且可遗传改造的植物病原螺原体Spiroplasma citri作为底盘，异源表达并加工弗洛勒斯金黄植原体（FD）的变膜蛋白VmpA，将其展示在螺原体表面，并探索分泌功能性效应蛋白的能力。

研究路线图

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核心内容

针对植原体无法体外培养、其表面蛋白VmpA与宿主互作机制难以研究的瓶颈，该工作以可培养且可遗传改造的植物病原螺原体Spiroplasma citri为底盘，尝试异源表达和加工弗洛勒斯金黄植原体的变膜蛋白VmpA。研究发现，融合S. citri黏附素ScARP3d信号肽后，VmpA能够以39.5 kDa的成熟形式正确定位并展示于螺原体表面，而使用vmpA自身启动子和信号肽时仅检测到38 kDa的加工形式且表达量较低；改用S. citri的tuf启动子可显著提高蛋白积累量。Triton X-114分配实验证实VmpAs全部富集于去污剂相，表明其整合在细胞膜上。此外，重组菌分泌的β-内酰胺酶在接种24小时后即表现出活性并使青霉素失活，72小时后活性覆盖整个平板。该工作首次在非近缘螺原体中实现植原体跨膜蛋白的正确加工与表面展示，并证明该系统能分泌功能性效应蛋白，为研究植原体表面蛋白与宿主互作及递送效应蛋白提供了可行平台。

创新点

首次在S. citri中实现了非近缘植原体跨膜蛋白VmpA的正确加工和表面展示；通过融合S. citri黏附素ScARP3d信号肽，实现了跨膜蛋白的膜定位；同时证明了该系统可分泌具有活性的β-内酰胺酶，为递送植原体效应蛋白提供了新平台。

研究对象（4）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Spiroplasma citri strain 44	蛋白质分泌通路（Sec途径）	vmpA	VmpA	区室化	异源表达FD植原体变膜蛋白VmpA，通过融合ScARP3d信号肽实现细胞膜定位和表面展示
Spiroplasma citri strain 44	蛋白质分泌通路（Sec途径）	bla	β-内酰胺酶	催化	无自身信号肽的β-内酰胺酶基因融合ScARP3d信号肽后，被分泌到培养基中并具有催化青霉素水解的活性
Spiroplasma citri strain 44	基因表达调控	tuf基因启动子及RBS	—	调控	使用S. citri tuf基因启动子驱动异源基因表达，显著提高了VmpA积累量
Spiroplasma citri strain 44	蛋白质分泌通路（Sec途径）	ScARP3d信号肽编码序列	ScARP3d信号肽	转运	引导融合蛋白跨膜转运并在加工后定位于细胞膜

关键发现

融合ScARP3d信号肽后，VmpA以39.5 kDa的成熟形式在S. citri表面展示，而使用vmpA自身启动子和信号肽时仅检测到38 kDa的加工形式且表达量较低
采用S. citri tuf启动子后蛋白积累量明显提高。Triton X-114分配实验表明VmpAs全部存在于去污剂相，证明其整合于细胞膜。重组菌分泌的β-内酰胺酶具有活性，在接种24 h后即可在琼脂板上使青霉素失活，72 h后覆盖整个平板。构建的vmpA片段长度分别为1,138 bp（信号肽缺失型）和1,661 bp（含自身启动子），ScARP3d信号肽融合片段为200 bp。

研究结论

本研究成功构建了表面展示FD植原体VmpA的重组S. citri，为研究植原体表面蛋白与宿主互作提供了新方法；同时，功能性β-内酰胺酶的分泌证明该表达系统可用于向宿主递送植原体效应蛋白，具有广阔应用前景。